SENAI CETIQT - Sequenciador de terceira geração chega ao ISI Biossintéticos

[Romildo de Paula Leite]

O sequenciador PacBio Sequel System já está disponível no SENAI CETIQT. É o segundo do país e pode ser utilizado em diversos setores da indústria como Saúde, Alimentos, Cosméticos, Agricultura, Bioenergia e outros atendidos pela Plataforma de Biologia Sintética. Além desses, também colabora para as instituições de pesquisa.

O sequenciamento de DNA foi desenvolvido pelo bioquímico britânico Frederik Sanger, em 1977, e é considerado um dos feitos científicos mais importantes da ciência. Hoje, é possível sequenciar de forma automatizada vários materiais genéticos, sejam de origem humana, animal, vegetal, vírus ou microrganismos. Essa metodologia determina a sequência das bases nucleotídicas (As, Ts, Cs, e Gs) em um pedaço de DNA. A informação contida no DNA é capaz de guiar a síntese de um produto biologicamente ativo, como uma proteína, que pode estar envolvida em processos de desenvolvimento e metabolismo. Também é atribuído ao DNA a hereditariedade (características que passa de pai para filho) e a variabilidade necessária para o processo evolutivo (mutações que podem ocorrer durante a vida).

Desde então, as metodologias para o sequenciamento têm evoluído e chegamos à Terceira Geração de sequenciadores. Em 2009, uma nova forma de sequenciar moléculas de DNA em tempo real foi estabelecida pela Pacific Biosciences (PacBio), culminando no lançamento de um sequenciador conhecido como SMRT (single-molecule real time). Ele também pode ser conhecido como sequenciamento de “long reads”, pois sua metodologia baseia-se em sequenciar fitas mais longas de DNA, o que pode ajudar na montagem de genomas inteiros (animal, planta ou microrganismos), estudar a diversidade microbiana de determinados ambientes (por exemplo, intestino ou boca), transcriptomas e epigenomas completos, entre outras pesquisas que podem ser realizadas a partir desta tecnologia inovadora.

A metodologia SMRT permite que o sequenciamento ocorra em células, cada uma contendo “poços” Zero-Mode Waveguides (ZMWs), e cada uma desses “poços” é iluminado na parte inferior por um laser capaz de detectar a adição de bases, por uma enzima, chamada de DNA polimerase, marcadas com fluorescência a um DNA molde. Apesar de todos os nucleotídeos marcados serem liberados ao mesmo tempo na célula de sequenciamento, os mesmos ficam em constante processo de difusão pelos detectores ZMW, e apenas o nucleotídeo no sítio ativo da polimerase encontra-se próximo o suficiente da região de detecção da fluorescência, de forma que a presença dos demais nucleotídeos marcados não interfere na detecção do sinal específico.

Nucleotídicos fluorescentes análogos, fosfolipados são introduzidos no ZMW

DNA polimerase imobilizada age no DNA de fita simples

A plataforma SMRT de sequenciamento requer quantidades mínimas de reagentes e preparo de amostra, além do rápido resultado por não possuir etapas de lavagem entre a incorporação de cada nucleotídeo marcado. Outra vantagem desta metodologia, é que não há necessidade de pré-amplificação das amostras para enriquecimento das bibliotecas de DNA. Uma vez que esta tecnologia se baseia na alta processividade da DNA polimerase, o SMRT tem os maiores tamanhos de reads entre as tecnologias de sequenciamento atuais, em média 1.000 pb, podendo chegar a um máximo de 30.000 pb. A taxa de erro das bases incorporadas neste sequenciamento é um pouco alta, porém, quando uma molécula é sequenciada com pelo menos 15 vezes de cobertura, a acurácia mediana das bases aumenta para 99.3%.

Parte interna do sequenciador PacBio Sequel System

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